поиск:   в магазине    на странице


 


Разделение белков методом денатурирующего электрофореза и методы окрашивания гелей

Анализ белков на мембранах

Хранение и анализ антител

Очистка антител



Разделение белков методом денатурирующего электрофореза и методы окрашивания гелей

Денатурирующий гель-электрофорез (по Лэмли, 1970)

10 x буфер Лэмли:0.25 Mтрис-HCl, pH 8.5
1.92 Mглицин
1%СДС
   
4%-ный буфер для нанесения проб:0.25 MТрис-HCl, pH 6.8
8%СДС
40%глицерол
20%ß-меркаптоэтанол
0.016%бромфеноловый cиний
   
Разрешающий гель:0.375 Mтрис-HCl, pH 8.8
12%акриламид (акриламид:бис-акриламид – 29 : 1)
0.1%СДС
0.06%персульфат аммония
0.006%TEMED
   
Концентрирующий гель:0.125 Mтрис-HCl, pH 6.8
5%акриламид
0.1%СДС
0.08%персульфат аммония
0.008%TEMED


  1. При использовании коммерческой аппаратуры, пожалуйста руководствуйтесь инструкцией производителя.

  2. Приготовьте раствор акриламида для разрешающего геля. Добавьте TEMED непосредственно перед заливкой геля. Гель полимеризуется втечение 5 – 10 мин после добавления TEMEDа.

  3. Залейте раствор акриламида между стеклами. Уровень залитого раствора не должен доходить до верхнего края стекол; оставьте место для гребенки и добавьте еще 1 см. Аккуратно наслоите на раствор акриламида изобутанол или воду. Для гелей с концентрацией акриламида ниже 8%-ов используйте воду; для гелей с 10%-ной концентрацией акриламида и выше исполььзуйте изобутанол. Поставьте гель вертикально и оставьте его для полимеризации при комнатной температуре.

  4. После того, как гель полимеризовался (через 20 - 30 мин или дольше), слейте изобутанол и промойте поверхность геля водой. Высушите поверхность геля бумагой.

  5. Приготовьте раствор акриламида для концентрирующего геля. Налейте раствор акриламида на заполимеризовавшийся разрешающий гель. Поместите гребенку в раствор, избегая образования пузырьков. Предварительно промойте гребенку в воде и протрите ее спиртом. Поставьте гель в вертикальное положение и оставьте его для полимеризации при комнатной температуре. Гель должен заполимеризоваться втечение 10 – 15 мин. Чем дольше полимеризуется гель, тем лучше в дальнейшем разделение белков.

  6. Проинкубируйте белковые пробы в 1 – 2-ом буфере для нанесения проб при 80°C втечение 10 мин.

  7. После того, как концентрирующий гель полимеризовался, осторожно вытащите гребенку. Промойте слоты дистиллированной водой для удаления неполимеризовавшегося акриламида. Если необходимо, выправите зубчики геля и поместите гель в электрофорезную камеру.

  8. Нанесите образцы в карманы геля. Белковые пробы можно нанести с помощью микролитрового шприца, либо с помощью микролитровой пипетки.

  9. Начните электрофорез при 100 – 125 V. После того, как фронт краски пройдет в разрешающий гель, увеличьте ток до 200 V.

  10. Когда фронт краски достигнет нижнего уровня геля, выключите ток. Снимите гель с электрофорезной аппаратуры и аккуратно откройте стекла, используя шпатель.

    Гель теперь готов к фиксированию, окрашиванию, переносу, флюорографии и авторадиографии.


Литература:
Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680 – 685



Окрашивание акриламидных гелей Кумасси синим

Окрашивающий раствор:40%этанол
5%уксусная кислота
0.2% (w/v)Кумасси синий (Р-250)
   
Открашивающий раствор:30%этанол
7%уксусная кислота


  1. Проинкубируйте гель в окрашивающем растворе втечение 30 мин при постоянном перемешивании.

  2. Отмойте гель в нескольких сменах открашивающего раствора (3 раза по 30 мин) до тех пор, пока не будут хорошо видны четкие синие полосы белков на прозрачном фоне геля.




Окрашивание акриламидных гелей нитратом серебра

Фиксирующий раствор:50%этанол (или метанол)
12%уксусная кислота
0.05%37% формальдегид
   
Раствор тиосульфата:0.02% (w/v)тиосульфат натрия
   
Раствор серебра:0.2% (w/v)нитрат серебра
0.075%37% формальдегид
   
Проявляющий раствор:6% (w/v)карбонат натрия
0.05%37% формальдегид
0.0004%тиосульфат натрия
   
Останавливающий раствор:50%этанол (или метанол)
12%уксусная кислота


  1. Проинкубируйте гель минимум 1 ч в фиксирующем растворе.

  2. Промойте гель три раза втечение 20 мин в 50%-ном растворе этанола (или метанола) с целью отмывки уксусной кислоты.

  3. Проинкубируйте гель одну минуту в растворе тиосульфата.

  4. Промойте гель три раза втечение 20 – 30 сек водой и проинкубируйте его в растворе серебра втечение 20 мин.

  5. Промойте гель три раза втечение 20 – 30 сек водой и проинкубируйте его с проявляющим раствором до тех пор, пока не появятся четкие полосы от желтого до коричневого цвета на прозрачном фоне геля.

  6. Остановите окрашивание останавливающим раствором.


Примечание: Время инкубации дано для гелей 1 мм толщиной. Если Вы используете гель 1.5 или 2 мм толщиной, то увелчите время инкубаций пропорционально толщине геля.



Окрашивание акриламидных гелей имидазолом

Окрашивание имидазолом не фиксирует белки в геле и поэтому может применяться до переноса белков на мембраны.

Буфер 1:0.2 M имидазол
  
Буфер 2:0.3 M цинк сульфата


  1. Проинкубируйте гель в буфере 1 при постоянном покачивании втечение 10 мин.

  2. Слейте буфер 1 и замените его буфером 2. Проинкубируйте гель в буфере 2 до появления четких прозрачных полос на матовом молочно-белом фоне геля. Для того, чтобы лучше видеть проявление полос, положите под гель черную ткань или бумагу.

  3. Остановите реакцию заменой раствора 2 на воду. Для переноса белков на мембрану, открасьте гель в нескольких сменах ПБС раствора до тех пор, пока гель не станет опять прозрачным.


Примечание: окрашивание имидазолом не может быть использовано, если необходимо окрашивание серебром. Окрашивание Кумасси синим может проводиться непосредственно после окрашивания имидазолом без предварительного открашивания.



Анализ белков на мембранах

Перенос белков на нитроцеллюлозную или PVDF мембрану влажным методом

10 x буфер для переноса:1.5 M глицин
0.2 M трис-HCl, pH 8.0


  1. Проинкубируйте нитроцеллюлозную мембрану и полиакриламидный гель в однократном буфере для переноса втечение 10 мин. Намочите PVDF мембрану в метаноле, этаноле или изопропаноле.

  2. Намочите два слоя ватмановской бумаги, вырезанной по размеру геля, в буфере для переноса и положите их на катодную пластиковую прокладку.

  3. Положите гель на бумагу и покройте его нитроцеллюлозной или PVDF мембраной.

  4. Покройте мембрану двумя слоями ватмановской бумаги, смоченной в однократном буфере для переноса, и накройте их анодной пластиковой прокладкой.

  5. Удалите пузырьки воздуха стеклянной пробиркой.

  6. Проведите перенос втечение 2 – 3 ч при постоянном напряжении 45V.

  7. Проинкубируйте мембрану после переноса при 80°C 10 мин для лучшего фиксирования белков.




Перенос белков на нитроцеллюлозную или PVDF мембрану полусухим методом

Анодный буфер 1:0.3 M трис-HCl, pH 8.0
  
Анодный буфер 2:0.025 M трис-HCl, pH 8.0
  
Катодный буфер:0.04 M ε-аминокапроновая кислота


  1. Намочите три слоя ватмановской бумаги в катодном буфере и положите их на катодную часть электрода.

  2. Намочите акриламидный гель в анодном буфере 2 и положите его на бумагу. Удалите пузырьки воздуха стеклянной пробиркой.

  3. Намочите мембрану в анодном буфере 2 и покройте ею гель.

  4. Намочите три слоя ватмановской бумаги в анодном буфере 1 и положите их на мембрану. Удалите пузырьки воздуха.

  5. Накройте сэндвич анодным электродом; при этом постарайтесь не сместить гель и мембрану. Подключите ток и проведите перенос втечение 2 ч при 0.8 mA на cм2 геля.


Примечание: Если Вы используете PVDF мембрану, не забудьте намочить ее предварительно в метаноле, этаноле или изопроаноле.



Окрашивание блота Пуансо С

10 x раствор Пуансо С:0.2% Пуансо С
3% три-хлор уксусная кислота
3% сульфосалициловая кислота
  
10 x ПБС:0.75 M NaCl
30.0 мM KCl
45.0 мM Na2HPO4 x 12 H2O
15.0 мM KH2PO4


  1. Проинкубируйте нитроцеллюлозную мембрану в однократном растворе Пуансо С около 30 мин.

  2. Перенесите мембрану в однократный раствор ПБС или воду и промойте ее несколько раз около 1 – 2 мин.

  3. Отметьте позиции белкового маркера карандашом. Нитроцеллюлозная мембрана готова для дальнейшего иммунологичного анализа.


Примечание: Окрашивание Пуансо С очень быстро, но непостоянно. Так как окрашивание является обратимым, мембрана может в дальнейшем использоваться для различных методов иммунологичного анализа.



Окрашивание блота индийскими чернилами

Раствор чернил:100 мкл индийских чернил (или им эквивалентных) в 100 мл 0.3%-ного раствора Твина 20 и 1 x ПБС
10 x ПБС:0.75 M NaCl
30.0 мM KCl
45.0 мM Na2HPO4 x 12 H2O
15.0 мM KH2PO4


  1. Промойте мембрану в двух сменах (по 100 мл) 0.4% раствора Твина 20 и однократного ПБС втечение 5 мин.

  2. Поместите мебрану в раствор чернил и проинкубируйте ее при комнатной температуре от 15 мин до 18 ч. Более продолжительные инкубации усиливают чувствительность окрашивания.

  3. Открасьте мембрану в многоразовых сменах однократного ПБС. Нитроцеллюлозная мембрана теперь готова для иммунологичного анализа.


Примечание: Очень важно использование правильных чернил. Для этого можно использовать чернила фирмы Пеликан или эквивалентные им чернила.



Вестерн-блот анализ с использованием антител хрена, конъюгированных с пероксидазой

10 x ПБС:0.75 M NaCl
30.0 мM KCl
45.0 мM Na2HPO4 x 12 H2O
15.0 мM KH2PO4
  
Блокирующий буфер:1 x ПБС
5% обезжиренное сухое молоко
1% твин 20
  
Отмывающий буфер:1 x ПБС
1% твин 20
  
Стоковый раствор 1:0.25 M люминол (в ДМСО)
  
Стоковый раствор 2:0.09 M п-кумариновая кислота (в ДМСО)
  
Проявляющий раствор 1:2.5 мM люминол
0.4 мM п-кумариновая кислота
0.1 M трис-HCl, pH 8.5
  
Проявляющий раствор 2:5.4 мM H2O2
0.1 M трис-HCl, pH 8.5


  1. Перенесите белки с акриламидного геля на нитроцеллюлозную или PVDF мембрану.

  2. Проинкубируйте мембрану в блокирующем буфере при комнатной температуре втечение 1 ч.

  3. Проинкубируйте мембрану с первичными антителами, разбавленными до желательной концентрации, втечение 2 ч при комнатной температуре или на ночь при 4°C.

  4. Слейте антитела (первичные антитела могут использоваться несколько раз) и промойте мембрану 4 раза по 10 мин в блокирующем буфере.

  5. Проинкубируйте мебрану 1 ч в разбавленных вторичных антителах (используйте антитела только один раз).

  6. Промойте мебрану 4 раза по 10 мин в отмывающем буфере.

  7. Приготовьте проявляющие растворы 1 и 2 и смешайте их 1 : 1. Проявите мембрану в этом растворе втечение 1 мин.

  8. Экспонируйте мембрану с рентгеновским фильмом (втечение 1 мин или дольше).




Хранение и анализ антител

Хранение неочищенных антител

  1. Добавьте 0.02%-ный ацид натрия к полученной сыворотке крови.

  2. Расфракционируйте антитела в удобном для работы объеме и заморозьте их при -20°C. Наибольшее количество антител стабильно втечение многих лет при хранении на -20°C.

  3. Рабочие фракции антител храните при +4°C; в этих условиях антитела стабильны минимум 6 месяцев.

  4. Избегайте многоразового повторного размораживания и замораживания антител.




Анализ полученных антител

Каждое полученное антитело требует тщательного анализа. Проведите хотя бы два следующих анализа антител.

  1. Определите титр (разбавление) антител, необходимое в дальнейшей работе. Для этого проведите разбавления антител: от 1 : 100 до 1 : 10.000. Проведите блот-анализ с подготовленными разведениями и определите наиболее оптимальную концентрацию антител.

  2. Проверьте, является ли полученный на Вестерн-блоте сигнал, специфичным для Вашего белка или сигнал может быть неспецифичным. В этом случае Вы можете блокировать антитела антигеном, как описано в компетиционном методе.




Иммунно-ферментативный анализ (ELISA)

Иммунно-ферментативный анализ является одним из методов определения концентрации антигена и антител. Описанный метод проводится при избытке антигена и может быть использован для определения наличия и титра антител. Этот метод особенно рекомендуется для проверки поликлональных неочищенных антител.

10 x ПБС:0.75 M NaCl
30.0 мM KCl
45.0 мM Na2HPO4 x 12 H2O
15.0 мM KH2PO4
  
Блокирующий буфер:1 x ПБС
5% обезжиренное сухое молоко (или 3% БСА)
0.5% Твин 20
  
Отмывающий буфер:1 x ПБС
0.5% Твин 20


  1. Для наибольшего количества тестов применяются поливинилхлоридные микролитровые чашки. Тем неменее, перед их использованием, проконсультируйтесь с фирмой-производителем о том, какие чашки наиболее подходят для связывания белков.

  2. Приготовьте раствор антигена (белка или пептида) с концентрацией 1 – 10 мкг/мл в однократном ПБС. Поливинилхлорид связывает приблизительно 100 нг белка на слот. Если необходимо максимально связать белок, используйте минимум 1 мкг белка на слот (20 мкг/мл). Нанесите 100 мкл разбавленного антигена в каждый слот. Проинкубируйте образцы 2 – 6 ч при комнатной температуре или на ночь при 4°C.

  3. Промойте чашки дважды однократным раствором ПБС.

  4. Места связывания белков должны быть заблокированы блокирующим буфером. Добавьте в чашки блокирующий буфер до верхней границы слот. Проведите инкубацию втечение 2 ч или на ночь во влажной атмосфере.

  5. Промойте чашки дважды однократным раствором ПБС.

  6. Разведите преимунную (контроль) и иммунную сыворотки (разведения от 1 : 100 до 1 : 100.000). Добавьте 50 мкл антител к покрытым антителами слотам. Проинкубируйте чашки 2 ч при комнатной температуре при аккуратном покачивании.

  7. Промойте чашки три раза однократным ПБС.

  8. Добавьте разведенные вторичные антитела. Следуйте рекоммендациям производителя антител. Проинкубируйте чашки 1 ч при комнатной температуре при постоянном размешивании.

  9. Удалите несвязанные вторичные антитела трехкратной промывкой однократным раствором ПБС.

  10. Добавьте проявляющий реагент, закупленный в одной из фирм. Следуйте указаниям распространителя.

  11. Определите абсорбцию проб при определенной длине волны (зависит от используемого субстрата).




Компетиционный тест

  1. Разбавьте Ваш антиген (пептид или белок), начиная с 0.1 : 1 молярного соотношения между антигеном и антителом. В некоторых случаях для компетирования антигена с антителами, необходимо превысить концентрацию антигена в 100 раз. Титрирование антигена очень важно для определения условий ингибирования.

  2. Добавьте разбавленные антитела к антигену и проинкубируйте 2 ч при комнатной температуре или ночь при 4°C.

  3. Для того, чтобы уменьшить фон, процентрифугируйте раствор 15 мин при 15.000 x g. Растворимая фракция может быть использована в дальнейшем иммунологическом анализе.

  4. Проведите Вестерн-блот с растворимой фракцией.

  5. Если Вы не получите сигнал на Вестерн-блоте с антителами, преинкубированными с антигеном, или сигнал будет очень сильно уменьшен, это будет означать, что антитела правильно реагируют с Вашим антигеном.


Примечание: если Вы использовали для создания антител пептид или белок, конъюгированный с белком-носителем, то этот метод может дать неправильные результаты.



Очистка антител

Очистка на колонке белка A (с низкой концентрацией соли)

Этот метод используется для очистки антител с высокой афинностью к белку A. Мышиные моноклональные антитела классов IgG2a and IgG2b очень хорошо связываются с белком A. Антитела класса IgG3 имеют среднюю, а молекулы IgG1 очень низкую афинностью к белку А. Наибольшее количество моноклональных антител из крыс не может быть очищено на колнке белка А.

Отмывающий буфер 1:100 мM трис-HCl, pH 8.0
  
Отмывающий буфер 2:10 мM трис-HCl, pH 8.0
  
Элюирующий буфер:100 мM глицин, pH 3.0
  
Собирающий буфер:1 M трис-HCl, pH 8.0


  1. Доведите pH иммуной сыворотки (антител) до 8.0, добавив 1/10-ую объема собирающего буфера 1.

  2. Пропустите раствор антител через колонку белка А. Эта колонка связывает приблизительно 10 - 20 мг антител на 1 мл сырого материала (одна молекула белка А связывает две молекулы антител). Сыворотка содержит около 10 мг/мл всех IgG.

  3. Промойте материал колонки десятью объемами колонки отмывающим буфером 1.

  4. Промойте колонку десятью объемами отмывающего буфера 2.

  5. Элюируйте антитела с колонки элюирующим буфером. Добавляйте этот буфер постепенно по 500 мкл на пробу. Соберите эльюат в 1.5 мл-ые пробирки, содержащие по 50 мкл собирающего буфера. Осторожно перемешайте содержимое пробирки для нейтрализации pH. Так же как и в случае всех растворов, избегайте образования пузырьков и пены в растворе, которые способствуют денатурации белков.

  6. Опредилите концентрацию иммуноглобулинов измерением абсорбции при 280 нм (1 оптическая единица соответствует приблизительно 0.8 мг иммуноглобулинов на 1 мл раствора).


Примечание: Для аналитических работ, при которых очищаются несколько антител на одной колонке, обратите особое внимание на отмывку колонки. Из-за того, что различные антитела имеют разную афинность к белку А, можно легко загрязнить одни антитела другими. Для того, чтобы предотвратить загрязнения, промойте колонку поочередно 2 М мочевиной, 1 M LiCl и 100 мM глицином (pH 2.5).

Литература: Harlow E and Lane D (1988) Antibodies. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory



Иммуноафинное связывание антител на антигенной колонке

Отмывающий буфер 1:10 мM трис-HCl, pH 7.5
  
Отмывающий буфер 2:100 мM глицин, pH 2.5
  
Отмывающий буфер 3:100 мM глицин, pH 2.5
  
Отмывающий буфер 4:100 мM триэтиламин, pH 11.5
  
Отмывающий буфер 5:10 мM трис-HCl, pH 7.5
500 мM NaCl


  1. Свяжите ковалентно антиген с материалом колонки. Большое количество различных материалов доступно на рынке.

  2. После связывания осторожно слейти излишки жидкости и соберите растворимую фракци. Измерьте концентрацию белка для подтверждения связывания белка. В большинстве случаев эффективное связывание превышает 90%.

  3. Перенесите материал со связанным антигеном на колонку. Промойте колонку 10-ю объемами отмывающего буфера 1, затем 10-ю объемами отмывающего буфера 2 и 10-ю объемами буфера 3. Проверьте pH последних капель после промывки трисом. Если рН не доходит до 8.8, продолжайте промывку. После этого добавьте еще 10 колоночных объемов отмывающего буфера 4 (свеже-приготовленного). Промойте колонку буфером 1 до тех пор, пока pH не достигнет 7.5.

  4. Пропустите поликлональные антитела через колонку для их связывания. Сыворотка не должна содержать никаких частиц. Если используется неочищенная сыворотка, разбавьте ее 1 : 10 в отмывающем буфере 1 предварительно перед нанесением на колонку. Раствор антител должнен быть пропущен через колонку три раза для полного связывания антител или нанесение антител должно протекать очень медленно при использовании перестальтического насоса.

  5. Промойте колонку 20-ю колоночными объемами отмывающего буфера 1, а затем 20-ю объемами отмывающего буфера 5.


Литература: Harlow E and Lane D (1988) Antibodies. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory



Элюирование антител с антигенной колонки

Элюирующий буфер 1:100 мM глицин pH 2.5
  
Элюирующий буфер 2:100 мM триэтиламин pH 11.5
  
Собирающий буфер:1 M трис-HCl pH 8.0
  
Нейтрализующий буфер:1 M трис-HCl pH 8.0
  
Отмывающий буфер 1:10 мM трис-HCl pH 8.8
  
Отмывающий буфер 2:10 мM трис-HCl pH 7.5


  1. Элюируйте антитела, связанные кислотно-чувствительными связями, промывая колонку 10-ю колоночными объемами элюирующего буфера 1. Соберите элюат в пробирке, содержащей один объем собирающего буфера.

  2. Промойте колонку отмывающим буфером 1 до тех пор, пока pH не достигнет 8.8.

  3. Элюируйте антитела, связанные щелочно-чувствитпельными связями, промывая колонку 10-ю объемами элюирующего буфера 2 (свеже приготовленного). Соберите элюат в пробирку, содержащую один колоночный объем собирающего буфера.

  4. Промойте колонку отмывающим буфером 2 до pH = 7.5. Для повторного использования колонки заполните ее 0.01%-ным раствором мертиолата.

  5. Соберите элюированные фракции антител и проведите диализ с ПБС буфером, содержащий 0.02%-ный азид натрия. Если необходимо, сконцентрируйте раствор антител преципитацией аммонием сульфата или через колонку белка А.


Литература: Harlow E and Lane D (1988) Antibodies. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory



Очистка антител методом иммуноблотта (в небольших количествах)

10 x ПБС:0.75 M NaCl
30.0 мM KCl
45.0 мM Na2HPO4 x 12 H2O
15.0 мM KH2PO4


  1. Проведите препаративный денатурирующий ПАГЕ с нанесенным антигеном.

  2. Перенесите антигенные белки на нитроцеллюлозную или PVDF мембрану.

  3. Блокируйте мембрану, проинкубируйте ее с первичными антителами и промойте в отмывающем буфере по стандартному методу Вестерн-блота.

  4. Отрежьте часть мембраны с одного края и проведите проявку Вестерн-блота.

  5. Оставшуюся часть мембраны храните в однократном ПБС буфере при 4°C.

  6. После определения места локализации антигена, сопоставьте проявленную часть мембраны с оставшейся.

  7. Вырежьте из оставшейся непроявленной мембраны область, содержащую антиген.

  8. Разрежьте ее на мелькие фрагменты и перенесите в пробирку. Добавьте 100 мМ глицин или 1 M KSCN и проинкубируйте втечение 10 мин.

  9. Отберите буфер и нейтрализуйте раствор антител 1/10-ой объема 1 M-ного раствора трис-HCl (pH 8.0) в случае элюирования глицином или разведите раствор антител 10-ю объемами онократного ПБС в случае элюирования KSCN. Антитела сейчас готовы для их дальнейшего использования.


Литература: Harlow E and Lane D (1988) Antibodies. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory





© 2024 AntiProt - Imprint